代謝物と栄養素をモニタリングするためのウェアラブル電気化学バイオセンサー

Nature Biomedical Engineering volume 6、pages 1225–1235 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

汗中の代謝産物を継続的にモニタリングするためのウェアラブル非侵襲性バイオセンサーは、通常、十分な量の生体液を生成するために激しい運動中に、十分に高い濃度で少数の分析物を検出できます。今回我々は、運動中や安静時の汗中の微量レベルの複数の代謝物や栄養素（すべての必須アミノ酸やビタミンを含む）を連続分析するためのウェアラブル電気化学バイオセンサーの設計と性能を報告する。バイオセンサーは、その場で繰り返し再生可能なグラフェン電極で構成され、代謝産物特異的な抗体のような分子インプリントポリマーと酸化還元活性レポーターナノ粒子で機能化され、イオントフォレシスベースの発汗誘発、マイクロ流体汗サンプリング、信号処理および信号処理のためのモジュールと統合されています。キャリブレーションとワイヤレス通信。ボランティアでは、バイオセンサーにより、運動中のアミノ酸の摂取量とそのレベルのリアルタイムモニタリング、およびメタボリックシンドロームのリスクの評価（血清と汗中のアミノ酸レベルを相関させることによる）が可能になりました。健康状態の異常を早期に特定するための代謝産物のモニタリングは、精密栄養学への応用を促進する可能性があります。

循環する栄養素は、全体的な健康と身体機能の重要な指標です1。アミノ酸（AA）は、食事摂取と腸内微生物叢の合成に由来し、個人のライフスタイルの影響を受けるため、多くの健康状態の重要なバイオマーカーです（図 1a）2。ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)、バリン (Val) などの分岐鎖アミノ酸 (BCAA) の増加は、肥満、インスリン抵抗性、2 型糖尿病 (T2DM)、心血管疾患 (CVD) の将来のリスクと関連しています。膵臓がん3、4、5。 AA（アルギニンやシステインなど）の欠乏は、免疫細胞の活性化を低下させ、免疫システムを妨げる可能性があります6。トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe) は、それぞれセロトニンとカテコールアミン神経伝達物質 (ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン) の前駆体であり、複雑な神経系の機能と精神的健康に重要な役割を果たしています 7,8。多くの代謝フィンガープリント（Leu、Phe、ビタミン D を含む）は、2019 年コロナウイルス感染症（COVID-19）の重症度に関連しています9,10。栄養における健康格差は、新型コロナウイルス感染症の脆弱性と死亡率によって悪化する憂慮すべき人種的および民族的格差ともよく相関しています11。さらに、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 によって引き起こされる臓器および組織の機能不全は、心臓代謝性疾患の発生率の増加を引き起こす可能性があります 12。

a、AA などの循環栄養素は、さまざまな生理学的および代謝状態に関連しています。 b. LEG、RAR、人工抗体の相乗的融合により代謝モニタリングを可能にするウェアラブル「NutriTrek」の概略図。 c、d、発汗誘発、サンプリング、およびバイオセンシング用のマイクロ流体「NutriTrek」パッチの概略図（c）および層アセンブリ（d）。 T、温度。 e、f、柔軟なセンサーパッチ (e) とスキンインターフェイスのウェアラブルシステム (f) の画像。スケールバー、5 mm (e) および 2 cm (f)。 g、「NutriTrek」の電子システムのブロック図。赤い破線で囲まれたモジュールはスマートウォッチバージョンに含まれています。 CPU、中央処理装置。 POT、電位差測定; 計装アンプ、計装アンプ。 MCU、マイクロコントローラー; TIA、トランスインピーダンスアンプ。 IP、イオン導入; CE、対電極。 RE、参照電極。私たち、作用電極。 h、リアルタイムの代謝および栄養追跡のためのカスタムモバイルアプリケーション。 i、使い捨てセンサーパッチと電気泳動ディスプレイを備えた「NutriTrek」スマートウォッチ。スケールバー、1 cm (上) と 5 cm (下)。

代謝プロファイリングとモニタリングは、精密栄養と精密医療を実現するための重要なアプローチです13。医学的評価および代謝検査における現在のゴールドスタンダードは、侵襲的かつ一時的な血液分析に大きく依存しており、多くの場合、医療施設への物理的な訪問、労働集約的なサンプル処理と保管、および繊細な機器（ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC）など）が必要となります。 –MS))14. 現在の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックは世界中で依然として制御されていないため、個人の健康状態を監視し、家庭や地域ベースの環境下でタイムリーな介入を可能にするウェアラブルセンサーや遠隔医療センサーの開発が急務となっている15、16、17、18。 19、20、21、22、23; また、ウェアラブルを使用して、T2DM12 などの潜在的な内分泌合併症の初期兆候を捕捉するために、重度の新型コロナウイルス感染症から回復した後の人の長期的な心臓代謝および栄養状態をモニタリングすることも、ますます重要になっています。

汗は、栄養状態および代謝状態を反映する豊富な化学物質を含む重要な体液です24、25、26、27。血液分析からウェアラブル汗分析への進歩は、人間の健康に重要な生理学的バイオマーカーの非侵襲的で継続的なモニタリングに大きな可能性をもたらす可能性があります28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38。しかし、現在報告されているウェアラブル電気化学センサーは、イオン選択電極や酵素電極、または電気活性分子の直接酸化を超える適切な連続モニタリング戦略が欠如しているため、主に電解質、グルコース、乳酸塩などの限られた数の分析物に焦点を当てています。 34、35、36、37、38、39、40。したがって、汗に含まれる臨床的に関連する栄養素や代謝物のほとんどはほとんど調査されておらず、既存のウェアラブルセンシング技術では検出できません。さらに、現在のウェアラブルバイオセンサーは通常、汗をかくために激しい運動を必要とします。最近のいくつかの報告では、座りがちな汗のサンプリングにピロカルピンゲルベースのイオントフォレシスを使用していますが 22,30,36、このアプローチでは、汗とゲル流体の混合と動的汗サンプリングの欠如により、発汗期間が短く、センシング精度が低いという問題があります。

この記事では、大量生産可能なレーザー彫刻グラフェン (LEG)、電気化学的に合成されたレドックス活性ナノレポーター (RAR)、および分子インプリントポリマー (MIP) ベースの「人工抗体」の賢明な組み合わせに基づく、普遍的なウェアラブルバイオセンシング戦略を紹介します。」、および独自の現場再生および校正技術も備えています (図 1b)。一般に 1 回限りの使用であり、標準的なイオン溶液中でのバイオアフィニティー相互作用を変換するには複数の洗浄ステップが必要となる、抗体または古典的な MIP に基づくバイオアフィニティーセンサーとは異なり、このアプローチにより、高感度、選択的、連続的なバイオアフィニティーセンサーの実証が可能になります。 9つの必須AAすべてに加え、人間の汗に一般的に見られるビタミン、代謝産物、脂質など、生体液中の幅広い微量レベルのバイオマーカーのモニタリング（補足表1）。このユニークなアプローチとその場での信号処理および無線通信をシームレスに統合することで、タイムリーな介入に向けてパーソナライズされた非侵襲的な代謝および栄養モニタリングを実行できる強力なウェアラブル汗センシング技術「NutriTrek」が実現します（図1b）。カルバコールイオントフォレーシスベースの発汗誘発と効率的なマイクロ流体ベースの周囲汗サンプリングの組み込みにより、身体運動時と安静時の活動全体にわたって、高い時間分解能と精度を備えた長時間の自律的かつ連続的な分子分析が可能になります。 5つの必須または条件付き必須AAA（つまり、Trp、Tryと3つのBCAA（Leu、Ile、Val））を例示的な栄養素として使用し、健康な被験者と患者の両方を登録して中枢性疲労の個別モニタリングを行うことにより、いくつかの人体試験でシステムを裏付けました。、標準的な食事摂取量、栄養状態、メタボリックシンドロームのリスク、および新型コロナウイルス感染症の重症度。

柔軟で使い捨てのセンサーパッチは、カルバコールを充填した2つのイオントフォレーシス電極、マルチインレットマイクロ流体モジュール、多重MIP栄養素センサーアレイ、温度センサー、電解質センサーで構成されています（図1c〜fおよび補足図1）。すべての柔軟な電極とセンサーの設計は、表面積が大きく、優れた電気化学的特性を備え、CO2 レーザー彫刻によってポリイミド（PI）基板上に直接大規模に製造できる LEG に基づいています（補足図 2）。センサーパッチは、コンフォーマル接触で皮膚に簡単に取り付けることができ、オンデマンドイオントフォレーシス制御、その場信号処理、およびBluetoothを介したユーザーインターフェイスとの無線通信用の小型電子モジュールとインターフェイスします（図1gおよび補足図3および4）。）。カスタムモバイルアプリ「NutriTrek」は、ウェアラブルセンサーによって監視される動的な代謝情報を処理、表示、保存するために開発されました（図1hおよび補足ビデオ1）。ウェアラブルシステムは、電子ペーパーディスプレイを備えたスマートウォッチにも統合されました (図 1i および補足図 5)。

LEG 上の選択結合 MIP 層を慎重に設計することにより、AA およびその他の代謝産物/栄養素を高い感度と選択性で普遍的に検出することができました。 MIP は、機能性モノマーとテンプレート分子を重合させることによって形成される、化学的に合成された受容体です。 MIP 技術はセンシング、分離、診断のために提案されていますが 42,43、古典的な MIP センサーはセンサー再生のために洗浄ステップを必要とし、検出は通常標準的な緩衝液または酸化還元溶液で行われるため、継続的なウェアラブルセンシングについてはまだ実証されていません。私たちの場合、機能性モノマー (ピロールなど) と架橋剤 (APBA など) は最初に標的分子と複合体を形成します。重合後、それらの官能基は LEG 上のポリマー構造に埋め込まれます。その後の標的分子の抽出により、サイズ、形状、電荷において標的分析物と相補的である LEG-MIP 電極上の結合部位が明らかになります（補足図 6）。直接的および間接的な 2 つの検出戦略は、ターゲット分子の電気化学的特性に基づいて設計されています (図 2)。 LEG-MIP センサーの最適化と特性評価については、補足注 1 と補足図で詳しく説明されています。 7-13。

a、LEG-MIP センサーを使用した電気活性分子の直接検出。 b、c、Tyr (b) および Trp (c) を直接検出するための LEG-MIP センサーの DPV ボルタモグラム。挿入図、線形フィットによるキャリブレーションプロット。 ΔJ、ピーク高さの電流密度。 d、50μM TrpにおけるLEG-MIP Trpセンサーのその場連続センシングと再生。 e. LEG-RAR-MIP センサーを使用した間接的な分子検出。 f、LEG-PBNP-MIP センサーを使用した間接 Leu 検出の LSV ボルタモグラム。挿入図、線形フィットによるキャリブレーションプロット。 g、h、LEG-PBNP-MIP センサーを使用した、すべての必須 AA (g) および複数のビタミン、脂質、代謝産物 (h) の間接検出。破線は線形近似傾向線を表します。 VC、ビタミンC; VB6、ビタミンB6; VD3、ビタミンD3; VE、ビタミン E.i、マルチ MIP AA センサーの回路図。 j、BCAA定量化のためのLEGマルチMIPセンサーのLSVボルタモグラム。挿入図、線形フィットによるキャリブレーションプロット。 k、50 µM Leu での LEG-PBNP-MIP Leu センサーのその場連続センシングと再生。 l、0.1 M KCl中でのLEG-PBNP電極の反復CVスキャン。 m、LEG-AQCA-MIP センサーを使用した間接 Leu 検出の DPV ボルタモグラム。挿入図、キャリブレーションプロット。 n、生の汗サンプルにおける LEG-AQCA-MIP Leu センサーのその場再生。 o、他のAAに対するTrp、Tyr、Leu、Ile、ValおよびBCAAセンサーの選択性。 p、生の運動汗サンプル (n = 20) を GC-MS に対して分析するための Tyr、Trp、Leu センサーの検証。すべてのエラーバーは、3 つのセンサーからの標準偏差 (sd) を表します。

汗中の電気活性分子の場合、MIPテンプレートに結合した標的分子の酸化は、ピーク電流の高さが分析対象物の濃度と相関する示差パルスボルタンメトリー（DPV）によって直接測定できます（図2a）。複数の電気活性分子が同様の電位で酸化される可能性があることを考慮すると、この LEG-MIP アプローチは感度と選択性の問題の両方に対処します。たとえば、近い酸化還元電位（約0.7 V）を持つ2つのAAであるTyrとTrpは、この戦略で選択的に検出できます（図2b、cおよび補足図14）。 LEG-MIP Tyr センサーおよび Trp センサーの感度がそれぞれ 0.63 μA μM-1 cm-2 および 0.71 μA μM-1 cm-2 のピーク高電流密度とターゲット濃度の間の線形関係が観察されました（補足図 15）。モノマー/架橋剤/テンプレートの比率とインキュベーション期間の選択はセンサーの応答に大きな影響を与えますが、サンプル量は影響しないことは注目に値します（補足図10）。 Tyr および Trp センサーは、結合したターゲットを酸化還元電位で酸化する高電圧アンペロメトリー電流時間 (IT) を使用して、洗浄ステップなしでその場で容易かつ繰り返し再生できます (図 2d)。

代謝産物や栄養素（BCAAなど）の大部分は非電気活性であり、動作条件下では簡単に酸化できないため、ここでは迅速な定量を可能にするためにLEG層とMIP層の間に挟まれたRAR層を含む間接的検出アプローチを利用します（図） .2e)。インプリントされたポリマー層へのターゲット分子の選択的吸着により、サンプルマトリックスへの RAR の露出が減少します。 DPV やリニアスイープボルタンメトリー (LSV) などの制御電位ボルタンメトリー技術は、RAR の酸化または還元ピークの測定に適用でき、ピーク高さの電流密度の減少は分析対象物レベルの増加に対応します。たとえば、プルシアンブルーナノ粒子（PBNP）をRARとして使用し（補足図11）、ピーク高さの減少とLeu濃度との間に対数線形関係があり、感度が702 nA mmのMIP-LEG Leuセンサーを開発しました。濃度 10 年あたり 2 (図 2f)。私たちは、9 つの必須 AA (つまり、Leu、Ile、Val、Trp、Phe、ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、メチオニン (Met)、およびスレオニン (Thr)) の生理学的に関連する範囲を定量化するこのアプローチを確立しました (図2gおよび補足図16）、ならびに多くのビタミン、代謝産物および脂質（ビタミンB6、C、D3およびE、グルコース、尿酸、クレアチン、クレアチニンおよびコレステロール）（図2hおよび補足図17））。これらの栄養素や代謝物に加えて、このアプローチは簡単に再構成でき、ホルモン (コルチゾールなど) から薬物 (免疫抑制剤ミコフェノール酸など) に至る幅広いバイオマーカーのモニタリングを可能にします (補足図 18 および補足表 2 および 3)。これらのターゲットのほとんどは、既存のウェアラブル技術では継続的に検出できません。多くの場合、複数の栄養素の合計レベル (たとえば、総 BCAA) が重要な健康指標であることを考慮すると、マルチテンプレート MIP アプローチを使用して、単一のセンサーで複数のターゲットの合計濃度を正確かつ高感度に検出できます (図) .2i,j)。これらの間接的な LEG-RAR-MIP センサーは、作用電極に定電位を印加することでその場で再生でき、結合したターゲット分子を MIP 層から反発させ、長期の再利用性を実現します（図 2k）。

LEG-MIPセンサーは、繰り返し使用中に安定した応答を示します。PBNPベースのRARは、60回の繰り返しサイクリックボルタンメトリー（CV）スキャン全体で安定した酸化還元シグナルを示しました（図2lおよび補足図11）。 42日間の保管期間を通して、最小限の出力変化が観察されました（補足図19a、b）。センサーは、5 日間連続して使用した場合でも、実質的な相対信号シフトを示さなかった（補足図 19c）。従来のMIP準備プロセスと比較して、大量生産可能なLEG上の電着MIP層は、選択性、感度、デバイス間の一貫性の高い再現性につながります（補足図20および21）。 MIP 堆積基板として LEG を選択すると、ガラス状炭素電極、印刷炭素電極、Au 電極などの古典的な電極と比較して、センサー感度の点で利点があることも示されました（補足図 22）。アントラキノン-2-カルボン酸（AQCA）などの他のRARも、安定した性能で間接AAセンシングに使用できます（ここでは、AQCAの減少を監視するためにネガティブスキャンされたDPVが使用されました）（図2mおよび補足図23）。図2nに示すように、LEG-AQCA-MIPセンサーは生の人間の汗サンプルで直接再生でき、ウェアラブルバイオセンシングの主なボトルネックを解決できます。 MIP-LEG AA センサーは、生理学的に関連する濃度で汗中の他の分析物（同様の構造を持つ AA を含む）に対して優れた選択性を示します（図 2o、補足図 24、および補足表 3）。 LEG-MIP テクノロジーは、現在のゴールドスタンダードである実験室ベースの GC-MS44 と同等の感度を示しました（補足図 25）。生の人間の汗サンプルのセンサー測定は、GC-MS に対して検証されています (図 2p および補足図 26 および 27)。

身体上の継続的な代謝および栄養モニタリングを可能にするために、柔軟なセンサーパッチは、局所的なオンデマンド汗誘発のためのイオントフォレーシスモジュール、効率的な汗サンプリングのためのマルチインレットマイクロ流体モジュール、多重 LEG-MIP 汗栄養素センサーアレイで構成されるように設計されました。連続 AA 分析用、およびリアルタイム AA センサー校正用の LEG ベースの温度および電解質センサー (図 3a)。緩衝液や酸化還元溶液中での古典的なバイオアフィニティーセンサーの検出とは異なり、その場での汗分析は、複雑で個人間で変化する汗の組成によりさらなる課題を引き起こし、正確な身体検知のための技術革新が必要です。たとえば、直接 LEG-MIP Trp センシングの場合、ターゲット/MIP 認識前であっても汗中の DPV スキャンは、少量の電気活性分子 (Trp や Tyr など) が表面で酸化される可能性があるため、酸化ピークを引き起こす可能性があります。 MIP層。 Trp が認識され、MIP キャビティに結合した後、実質的により高い電流ピーク高さが得られます。 2 つのピークの高さの差を測定することにより、汗中の結合 Trp を高い選択性で直接、より正確に測定できます (図 3b–d)。 AAセンサーに対する温度とイオン強度の影響は、LEGベースのひずみ抵抗温度センサーとイオン選択性Na +センサーからの読み取り値に基づいてリアルタイムで校正できます（図3eおよび補足図28）。。運動中の発汗量が特定のバイオマーカーレベルに影響を与えると報告されていることを考慮すると、汗の Na+ レベル (発汗量と線形相関を示した) を使用して、個別の分析のために栄養素レベルをさらに校正することができます。 2 ステップの DPV スキャンと温度/電解質キャリブレーションの両方を含むこのユニークな変換戦略により、身体使用中の汗の中で継続的に正確な読み取り値を取得することができます (補足図 29)。

a、多機能ウェアラブルセンサーパッチのイラスト。 ISE、イオン選択性電極。 b–d、Tyr の存在下でその場での選択的な Trp センシングを可能にする 2 スキャンセンサーの校正戦略。 ΔI、ピーク高さの電流。 ΔI'、ターゲット認識によって生じるピーク高さの差。 c と d の実線と破線の曲線は、線形近似傾向線を表します。 e、線形フィットを使用した、AA センサー読み取り値の電解質校正。 f、ムスカリン作用物質: ピロカルピンとカルバコールを使用したイオン導入汗抽出に基づく局所的な汗サンプリングの概略図。 g、h、ピロカルピンとカルバコールを用いた5分間のイオン導入後の、刺激された皮膚領域（g）および周囲の皮膚領域（h）から測定された局所発汗量。実線と破線の曲線は二次近似近似傾向線を表します。 S、被験者。 i、入口流体が 20 μM Trp から 80 μM Trp に変化した後 120 秒後のマイクロ流体リザーバー内の Trp 濃度 ([Trp]) 分布 (流速 1.5 μl min−1) の数値シミュレーション (入口番号、角度スパン、および入口と出口の方向）。ｊ、効率的なカルバコールベースのイオン導入による発汗誘発および安静時の周囲サンプリングのための最適化された柔軟なマイクロ流体パッチの身体上評価。タイムスタンプは、5 分間のイオン導入セッション後の期間 (分) を表します。マイクロフルイディクスにおける汗の流れの直接視覚化を容易にするために、リザーバーに黒色の染料が使用されました。スケールバー、3 mm。

このウェアラブル技術を、特に座りっぱなしの人に広く適用できるようにするために、ここでは持続可能な汗の抽出のためにムスカリン様物質カルバコール（カルベーゲル）を含むヒドロゲルと結合した LEG アノードとカソードで構成されるカスタム設計のイオントフォレーシスモジュールを利用します。カルバコールは、追加のニコチン様効果により、周囲の汗腺からの最も効率的で再現性があり、持続的な汗分泌を可能にするため、さまざまなムスカリン様物質から選択されました45（図3f〜h、補足図30および補足注記2）。対照的に、標準的な汗検査や以前に報告されたウェアラブルシステムで使用される古典的な発汗誘発剤であるピロカルピンは、短期間の発汗のみであり、隣接する汗腺からの発汗量は非常に限られています（図3f–h）。）。さらに、ピロカルピンゲルの下に漏れた汗とゲル液の混合物をサンプリングすると、汗を効果的にリフレッシュできないため、ウェアラブルセンサーに重大なエラーが発生し、リアルタイムの情報が得られなくなる可能性があります。当社のイオン導入モジュールでは、一般的に使用される 1 ～ 1.5 mA (参考文献 22、30、36) と比較して、非常に小さな電流 (50 ～ 100 μA) が使用されるため、皮膚刺激のリスクが大幅に軽減されます。少量の汗サンプリングの効率を最大化し、ウェアラブルセンシングの時間分解能を向上させるために、コンパクトで柔軟なマイクロ流体モジュールが、汗のサンプリング領域をイオン導入ゲルから隔離するように慎重に設計されました。数値シミュレーションを実行して、リザーバー幾何学に対する入口番号、角度スパン、方向および流れの方向を含むマイクロ流体モジュールの幾何学的設計を最適化しました（図3i、補足注記3、補足図31および32、補足ビデオ2）および補足表4)。汗の誘導とサンプリングの最適化された設計により、汗を局所的に便利に誘導し、複数の入口のマイクロフルイディクスで長期間にわたって容易にサンプリングできます（図3g、j、補足図33および補足ビデオ3）。 0.15μl min-1から3μl min-1の範囲の生理的発汗量では、ウェアラブルセンサーパッチはAAレベルの動的変化の信頼性が高く正確な分析を提供できます（補足図34および35）。

ウェアラブルシステムの評価は、まず、定負荷サイクリング運動試験中のヒト被験者の汗のTrpとTyrのセンシングによって行われました（図4a〜dおよび補足図36）。センサーからの DPV データは、温度および Na+ センサーの読み取り値とともにモバイルアプリにワイヤレスで送信され、カスタム開発された反復ベースライン補正アルゴリズム (図 4e および補足図 37) を使用して酸化ピークが自動的に抽出され、汗のTyrとTrpを正確に定量化します。 AA（たとえば、Try や BCAA）が運動中の中枢性疲労において重要な役割を果たすことを考慮して 46、柔軟な Trp および BCAA センサーアレイを使用して、激しい運動中の AA ダイナミクスを監視しました（図 4f–j および補足図 38）。）。運動中には、Trp レベルと BCAA レベルの両方が、それぞれセロトニン合成と BCAA 摂取により減少しました。汗のTrp対BCAA比の増加が観察され、これは中枢性疲労の指標として機能する可能性があり、血漿対応物に関する以前の報告と一致しています46。

a〜d、サイクリング運動中のリアルタイムセンサーキャリブレーションを備えたウェアラブルセンサーアレイを使用した継続的なオンボディTrpおよびTyr分析。 e. 多項式フィッティングおよびカットオフ手順に基づく自動ピーク抽出戦略を使用したカスタムボルタモグラム解析。 f – j、中枢疲労モニタリングを目的とした、身体運動中の動的発汗TrpおよびBCAA分析。 h–j の破線は、二次近似傾向線を表します。 k-o、個別の栄養モニタリングを目的とした、安静時の Trp および Tyr サプリメント摂取の有無による汗の AA レベルの動的分析。

ソースデータ

ウェアラブルなイオン導入統合パッチにより、運動以外の安静時でも毎日の継続的な AA モニタリングが可能になります。図4k〜oおよび補足図に示すように。図３９〜４２に示されるように、ＴｒｐおよびＴｙｒサプリメント摂取後、４人の被験者全員で汗中のＴｒｐおよびＴｙｒレベルの上昇が観察されたが、摂取なしの研究中、センサーからの読み取り値は安定したままであった。このような機能により、個人向けのセンサーに基づく食事介入を通じて、個人向けの栄養モニタリングと管理への扉が開かれます。私たちのパイロット研究では、汗の栄養素と電解質のレベルが、カルバコールベースのイオントフォレシス誘発発汗中の発汗速度の変化とは無関係であることが示されたことに注意してください（補足図43）。

腹部肥満とインスリン抵抗性を特徴とするメタボリックシンドロームは、現在、罹患率と死亡率の主な原因として増加しており、米国の成人の 3 分の 1 以上が罹患しています47。循環BCAAレベルの上昇は、インスリン抵抗性肥満やメタボリックシンドロームの予兆であり、CVDやT2DM（図5aおよび補足注4）3,4と関連しており、重篤な新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の潜在的な合併症を引き起こす可能性があります（参考文献12）。）。最近の研究では、インスリン抵抗性を改善するための食事介入として BCAA サプリメントを使用できる可能性が示されています 48。必須栄養素レベルの変化をモニタリングすることで、メタボリックシンドロームのリスクを高感度で早期に検出でき、効果的な個別化された食事介入が可能になります（図5b）。メタボリックシンドロームの非侵襲的危険因子としての汗BCAAの使用を調査するために、我々は3つの被験者グループ（正常体重（I、n = 10）、過体重/肥満（II、n = 7）およびT2DMを伴う肥満（III、n = 3）（図5c、d）。汗と血清の Leu レベルと総 BCAA レベル (すべてセンサーで分析) の間で、それぞれ 0.66 (n = 65) と 0.69 (n = 65) の正のピアソン相関係数が観察されました (図 5c)。グループ I の健康な参加者と比較して、グループ II および III では汗および血清 Leu レベル（センサーで分析）の大幅な上昇が観察されました（図 5d）。これは、肥満および肥満のある個人でより高い循環 BCAA レベルが特定されたという以前の報告と一致しています。 T2DM3。インスリン産生とグリコーゲン分解の阻害に対するBCAAの確立された役割を考慮して、健康な被験者におけるBCAAサプリメントと食事摂取後の汗Leu / BCAAと血糖/インスリンの食後反応も調査しました（図5e、f）。。すべてのバイオマーカーは絶食期間中安定したままでした。プロテインダイエットの摂取は血糖値とインスリンの両方の増加をもたらしましたが、BCAAの摂取はインスリンの急速な増加のみを引き起こしました。どちらの研究でも、汗LeuとBCAAは30〜60分で最初に増加し、その後減少しました。代謝条件が異なる被験者では、BCAA後のイオン導入汗中のLeuレベルの変化が異なります。すべてのケースで汗のLeuレベルの大幅な増加が観察されましたが、健康な被験者では急激なパーセンテージの変動が見られ、肥満/T2DMの人では変動が鈍化しました。それらの個人におけるBCAAの異なる代謝段階（図5g）。

a、肥満および/またはT2DMの個人で確認されたBCAAレベルの上昇。 b. 健康なグループと肥満/T2DM グループにおける BCAA 代謝とインスリン反応の間の密接な関連性。 c、LEG-MIPセンサーで得られた血清と汗の総BCAAおよびLeuレベルの相関関係（n = 65）。破線は線形近似傾向線を表します。 d、3 つの参加者グループにおけるイオントフォレーシスで抽出された汗と血清中の Leu レベルの測定値の箱ひげ図プロット:正常体重 (グループ I、n = 10)、過体重または肥満 (グループ II、n = 7)、および肥満T2DM (グループ III、n = 3)、下のひげは最小値を表し、上のひげは最大値を表し、ボックス内の四角は平均値を表します。 e、f、5 gのBCAA（e）と標準的なタンパク質食（f）を摂取した2人の健康な被験者からの汗Leuおよび総BCAA、血清インスリン（Ins）および血糖（BG）レベルの動的変化。 g、BCAA 5 g 摂取後のグループ I ～ III から収集されたスウェットリューの動態。挿入図、BCAA摂取後50分におけるLeuレベルと摂取前のレベルの比。 h、COVID-19陰性被験者（n = 8）およびCOVID-19陽性患者（n = 8）からの血清サンプルにおける、COVID-19重症度の代謝フィンガープリントとしてのLeuの評価。エラーバーは 3 つの測定値からの標準偏差を表します。

ソースデータ

循環する Leu の上昇が、新型コロナウイルス感染症の重症度の重要な代謝フィンガープリントとして報告されていることを考慮して、新型コロナウイルス感染症患者と健康な人から採取したサンプルを分析するためのバイオセンサーも評価しました。新型コロナウイルス感染症陽性サンプルでは、陰性サンプルと比較してLeuレベルの大幅な上昇が確認され（415.6±133.7対151.5±36.0μM）、在宅での新型コロナウイルス感染症のモニタリングと管理における当社のバイオセンサーの大きな可能性を示しています（図5h）。）。

AA やビタミンなどの循環代謝バイオマーカーは、糖尿病や CVD などのさまざまな健康状態と関連しています。ウェアラブルセンサーを使用した代謝プロファイリングは、特に新型コロナウイルス感染症パンデミックの時代において、精密栄養学と精密医療においてますます重要になっています。これは、新型コロナウイルス感染症の重症度に関する洞察だけでなく、代謝の健康を維持して感染症のリスクを最小限に抑えるための指針も提供するためです。新型コロナウイルス感染症の可能性。パンデミックが世界中で猛威を振るい続け、通常の医療サービスが不足するリスクにさらされているため、代謝プロファイリングを通じて健康状態を監視し、在宅診断や遠隔医療によるタイムリーな介入を実現できるウェアラブルセンサーの開発と応用が急務となっている。しかし、現在のウェアラブル電気化学センサーは、イオン選択性電極や酵素電極を超える連続感知戦略が欠如しているため、狭い範囲の検出ターゲットに限定されています。抗体や MIP を使用してより広範囲の標的を検出するために、さまざまな生体親和性に基づくセンサーが開発されていますが、それらは一般に複数の洗浄ステップが必要か、または 1 回しか使用できません。これらの制限により、ウェアラブルデバイスでの使いやすさが妨げられてきました。さらに、ウェアラブルバイオセンサーの大部分は、汗を取り込むために激しい運動に依存しており、毎日の連続使用には適していません。

大量生産可能な LEG、電気化学的に合成された RAR、および「人工抗体」を統合することにより、当社は、広範囲のバイオマーカー (すべての必須 AA、ビタミン、代謝産物、脂質、ホルモン、薬物）と信頼性の高いその場での再生。さらに、活動全体にわたる継続的かつオンデマンドの代謝および栄養モニタリングを可能にするために、最適化されたマルチインレットマイクロ流体発汗運動軸索反射汗サンプリングを備えた LEG-MIP センサーアレイとイオン導入ベースの発汗誘発をワイヤレスウェアラブル技術に統合しました。現場での信号処理、校正、無線通信。この遠隔医療技術を使用して、メタボリックシンドロームのリスクを特定するために、食後のAA反応をウェアラブルで継続的にモニタリングすることを実証しました。汗と血清BCAAの間の高い相関関係は、この技術がメタボリックシンドロームのリスクモニタリングでの使用に大きな期待を持っていることを示唆しています。新型コロナウイルス感染症陽性の血液サンプルと新型コロナウイルス感染症陰性の血液サンプルの間の Leu の大きな違いは、この技術を在宅での新型コロナウイルス感染症管理に使用できる可能性を示しています。私たちは、このウェアラブル技術が、循環バイオマーカーを継続的にモニタリングし、個別化された栄養介入を可能にすることで、精密な栄養補給の実現に重要な役割を果たすことができると考えています。この技術は、個人に合わせた幅広い予防、診断、治療用途に向けて、他のさまざまなバイオマーカーを継続的に監視するように再構成することもできます。

尿酸、l-チロシン、硝酸銀、塩化鉄(III)、塩酸ドーパミン、塩化コリン、クレアチニン、パントテン酸カルシウム塩、シトルリン、ピリドキシンおよび乳酸は、Alfa Aesar から購入しました。チオ硫酸ナトリウム5水和物、亜硫酸水素ナトリウム、トリプトファン、ロイシン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、リジン、チアミン塩酸塩、セリン、硫酸、塩酸、AQCA、3-アミノフェニルボロン酸（APBA）、アニリン、o-フェニレンジアミン、メチレンブルー、チオニン、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸水和物(MES)、エタノールアミン、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド(EDC)、N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩(スルホ-NHS)、ウシ血清アルブミン (BSA)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 (Tris-HCl)、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体 (Roche)、およびヒドロキノンは Sigma-Aldrich から購入しました。カルボン酸修飾磁気ビーズ (MB; Dynabeads、M-270) は Invitrogen から入手しました。フェリシアン化カリウムおよびフェロシアン化カリウムは、Acros Organics から購入しました。酢酸、メタノール、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素カリウム、尿素、l-アスコルビン酸、無水ブドウ糖（d-グルコース）、グリシン、アルギニン、イノシトール、オルニチン、アスパラギン酸、スレオニン、ヒスチジン、リボフラビン、クレアチン、フェニルアラニン、ニコチン酸、葉酸、グルタミン酸、および過酸化水素 (30% (w/v)) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。インスリン捕捉抗体およびビオチン化検出抗体は、R&D system (ヒト/イヌ/ブタ Insulin DuoSet ELISA) から購入しました。スクリーン印刷されたカーボン電極と磁気ホルダーは Metrohm DropSens から購入しました。医療用接着剤は 3 M および Adhesives Research から購入しました。 PI フィルム (厚さ 75 μm) は DuPont から購入しました。 PET フィルム (厚さ 12 μm) は McMaster-Carr から購入しました。

LEG 電極は、50 W CO2 レーザーカッター (Universal Laser System) を使用して、厚さ 75 μm の PI フィルム (DuPont) 上に作製されました。 CO2 レーザーカッターで PI を彫刻すると、吸収されたレーザーエネルギーが局所的な熱に変換され、局所的な温度が高くなり (>2,500 °C)、PI ネットワーク内の化学結合が破壊され、炭素が熱的に再組織化されます。原子が発生し、グラフェン構造のシートが形成されます。グラフェン電極と電子接続の最適化パラメータは、3 回スキャンのラスターモードで電力 8%、速度 15%、インチあたりのポイント (PPI) 1,000 でした。温度センサーのアクティブ検知領域の最適化パラメーターは、1 回スキャンのベクトルモードで電力 3%、速度 18%、PPI 1,000 でした。参照電極を準備するために、電気化学ワークステーション (CHI 832D) を使用して、-0.01 mA 150 秒、-0.02 mA 50 秒、-0.05 mA 50 秒の多電流電着によって、対応するグラフェン電極上に Ag を最初に修飾しました。 0.25 M 硝酸銀、0.75 M チオ硫酸ナトリウムおよび 0.5 M 亜硫酸水素ナトリウムを含むめっき溶液を使用して、50 秒間で 0.08 mA、350 秒間で -0.1 mA。 Ag/AgCl 電極を得るために、0.1 M FeCl3 溶液をさらに 30 秒間 Ag 表面に滴下し、次に 79.1 mg の PVB と 50 mg の NaCl を 1 ml のポリビニルブチラール (PVB) に溶解して調製した 3 μl のポリビニルブチラール (PVB) 参照カクテルを滴下しました。メタノールをAg/AgCl電極上に滴下し、一晩乾燥させた。 Na+ 選択性電極は次のように調製しました。 1 mg の Na イオノフォア X、0.55 mg のテトラキス [3,5-ビス(トリフルオロメチル) フェニル] ホウ酸ナトリウム、33 mg のポリ塩化ビニル、および65.45 mgのセバシン酸ビス(2-エチルヘキシル)を660 μlのテトラヒドロフランに加え、グラフェン電極上にドロップキャストし、一晩乾燥させた。長期間の連続測定で望ましい安定した Na+ センシング性能を得るために、得られた Na+ センサーを 100 mM NaCl 中で一晩コンディショニングしました。

LEG-MIPセンサーアレイの製造プロセスを補足図6に示します。すべてのMIP層は電解重合によって合成されます。重合溶液は、５ｍＭの鋳型（例えば、標的ＡＡ）、１２．５ｍＭのＡＰＢＡ、および３７．５ｍＭのピロールを０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）に溶解することによって調製した。マルチ MIP BCAA センサーの場合、各ターゲット (つまり、Leu、Ile、および Val) を 5 mM 使用しました。 MIP 堆積の前に、LEG を 0.5 M H2SO4 中で 60 セグメントの CV スキャン (スキャン速度 500 mV s-1 で -1.2 ～ 1 V) で活性化しました。直接検出 LEG-MIP センサーの場合、調製した重合溶液を使用して、CV 蒸着 (0 ～ 1 V を 10 サイクル、50 mV s-1) により、ターゲットのインプリントポリマーを LEG 電極上に電気化学的に合成しました。電極を酢酸/メタノール混合物 (7:3 v/v) に 1 時間浸漬することにより、標的分子を抽出しました。続いて、安定した応答が得られるまで、得られた電極を 0.01 M PBS (pH 6.5) に浸漬し、CV スキャン (スキャン速度 50 mV s-1 で 0.4 ～ 1 V) を繰り返しました。 LEG 非インプリントポリマーの場合、重合溶液にテンプレートを添加しなかったことを除き、LEG-MIP と同じ手順に従って電極を調製しました。

間接検出 MIP センサーの場合、電気化学的に合成された RAR (PBNP や AQCA など) が最初に LEG 電極上で修飾されました。 LEG 上の PBNP RAR は、3 mM FeCl3、3 mM K3Fe(CN)6、0.1 M を含む水溶液中で CV (20 サイクル) (スキャン速度 50 mV s-1 で -0.2 ～ 0.6 V) で調製されました。 HCl および 0.1 M KCl。最終的な MIP センサーで良好な感度を実現するには、適切な酸化還元シグナルを備えた PBNP 層が必要です。この安定した適切な酸化還元シグナルを達成するために、最初のプルシアンブルー (PB) 堆積後に LEG 電極を蒸留水ですすぎ、0.1 M KCl 溶液で安定した 70 μA LSV ピークが得られるまで PB 電着ステップをさらに 2 回繰り返しました。達成。続いて、LEG-PB を蒸留水ですすぎ、安定した応答が得られるまで繰り返し CV スキャン (スキャン速度 50 mV s-1 で -0.2 ～ 0.6 V) のために 0.1 M HCl と 0.1 M KCl を含む溶液に浸漬しました。得られた。 LEG 上で AQCA RAR を調製するために、まず LEG 電極を 5 mM AQCA を含む 50 μl PBS (pH 6.5) 中で 4 °C で一晩インキュベートしました。続いて、安定した応答が得られるまで、LEG-AQCAを蒸留水ですすぎ、リン酸緩衝液に浸漬してCVスキャン（スキャン速度50 mV s-1で-0.8〜0 V）を繰り返しました。間接検出 LEG-PB-MIP センサーの場合、テンプレート抽出直後に追加の PB 活性化プロセス (0.5 M HCl 中で 1 V で 600 秒間の IT スキャン) が実行され、続いて LEG-PB-MIP センサーの安定化プロセスが実行されました。 0.1 M KCl中（CVスキャンは-0.2～0.6 V、スキャン速度50 mV s-1）。 LEG-AQCA-MIP センサーの場合、MIP 層の調製に 3 CV サイクルの重合のみが使用され、センサーは 0.01 M PBS (pH 6.5) で安定化されました (-0.8 ～ 0 で CV スキャン)。スキャン速度 50 mV s-1) の V。

材料の形態は、走査型電子顕微鏡 (Nova Nano SEM 450) および透過型電子顕微鏡 (Talos S-FEG FEI、米国) によって特徴付けられました。異なる修飾を施した電極のラマンスペクトルは、inVia Reflex (Renishaw) を備えた 532.8 nm レーザーを使用して記録されました。フーリエ変換赤外スペクトルは、赤外分光計 (Nicolet 6700) を使用して測定しました。

一連の電気化学センサーは、対象分析物の溶液中で特性評価されました。すべての in vitro センサーの特性評価は CHI 832D を通じて実行されました。 Na+ センサーの応答は、さまざまな Na+ レベルを含む溶液中での開回路電位測定によって特徴付けられました。 DPV 分析は、すべての直接検出 LEG-MIP センサーの特性評価について、0.01 M PBS (pH 6.5) または生の汗中で実行されました。 DPV 条件は次のとおりです。範囲、0.4 ～ 1 V。増分電位、0.01 V。パルス振幅、0.05 V; パルス幅、0.05秒。パルス周期、0.5秒。感度、1 × 10−5 AV−1。 LEG-PB-MIP センサーに基づく標的分子の in vitro 間接検出では、LSV 分析 (0.4 ～ 0 V) を 0.1 M KCl 中で実行しました。 LSV 条件は次のとおりです。範囲、0.4 ～ 0 V。走査速度、0.005 V s−1。サンプル間隔、0.001 V。静かな時間、2 秒。感度、1 × 10−4 AV−1。 LEG-AQCA-MIP センサーに基づく標的分子の in vitro 間接検出では、0.01 M PBS でネガティブ DPV 分析 (0 ～ -0.8 V) を実行しました。負の DPV 条件は次のとおりです。0 ～ -0.8 V。増分電位、0.01 V。パルス振幅、0.05 V; パルス幅、0.05秒。パルス周期、0.5秒。感度、1 × 10−5 AV−1。現場での汗分析物の測定では、インキュベーションの前後にバックグラウンドとシグナル曲線が記録されました。シグナル電流は、インキュベーション後のシグナルとバックグラウンド電流曲線の間のピーク振幅の差として得られました（図3b〜dおよび補足図29）。温度センサーの特性評価は、セラミックホットプレート（Thermo Fisher Scientific）上で実行されました（補足図28）。センサーの応答はパラメーターアナライザー (Keithley 4200A-SCS) を使用して記録され、赤外線温度計 (LASERGRIP 800; Etekcity) の読み取り値と比較されました。

MIP ベースの AA センシング用のさまざまな電極基板の性能を評価するために、LEG、印刷カーボン電極、Au 電極、およびガラス状カーボン電極が選択されました。ガラス状炭素電極は CH Instruments から購入しました。印刷されたカーボン電極は、Dimatix Materials Printer DMP-2850 (Fujifilm、港、日本) を使用し、NovaCentrix の市販カーボンインクを使用して PI 基板上に印刷されました。 Au 電極は電子ビーム蒸着によって製造されました。20 nm の Cr と 100 nm の Au が、O2 プラズマで前処理された PET 基板上に蒸着されました。 MIP フィルムは CV 蒸着 (0 ～ 1 V で 10 サイクル、50 mV s-1) で調製されました。

マイクロ流体モジュールは、50 W CO2 レーザーカッター (ユニバーサルレーザーシステム) を使用して製造されました (補足図 1)。簡単に言うと、両面および片面の医療用接着剤 (3M) の層に、チャネル、注入口、イオン導入ゲルの輪郭、およびリザーバーをパターン化しました。すべてのマイクロ流体層について、上部の PI 電極層からの電流の流れを可能にするために、イオン導入ゲルの輪郭がパターン化されています。皮膚に接触する両面接着層である最下層（蓄積層）は、汗蓄積ウェル（3M 468MP、レーザーパラメータ：出力60%、速度90%、PPI 1,000）でパターン化されました。蓄積層と接触する 2 番目の層 (入口層) は、複数の入口 (厚さ 12 μm の PET、レーザーパラメーター: 出力 20%、速度 100%、PPI 1,000) でパターン化されました。入口層と接触する第 3 層 (チャネル層) は、マイクロ流体チャネル (Adhesives Research 93049、レーザーパラメーター: 出力 45%、速度 100%、PPI 1,000) でパターン化されました。チャネル層と電極 PI 層の間に挟まれた 4 番目の層 (リザーバー層) は、リザーバーと出口 (3M 468MP、レーザーパラメーター: 出力 60%、速度 90%、PPI 1,000) でパターン化されました。リザーバーは、長軸が 5.442 mm、短軸が 4.253 mm の楕円形で、アクティブな検出領域を完全に囲みます。チャネル層の厚さは約 0.1 mm (Adhesives Research 93049)、リザーバー層の厚さは 0.13 mm (3M 468MP) です。リザーバー面積は 18.17 mm2 であるため、リザーバー容積は面積とリザーバー層の厚さ (0.13 mm) の積として計算でき、合計は 2.36 μl になります。

ムスカリン様物質カルバコールを含むヒドロゲルを以下のように調製した。簡単に説明すると、アノードゲルの場合、アガロース (3% w/w) を脱イオン水に加え、一定の撹拌下で 250 °C に加熱しました。混合物が完全に沸騰し、アガロース粒がなくなり均質になった後、混合物を165℃まで冷却し、1%カルバコールを上記混合物に添加した。続いて、冷却した混合物を、あらかじめ作成した円筒型または組み立てたマイクロ流体パッチにゆっくりと注ぎ、4℃で10分間固化させました。カソードゲルは、カルバコールの代わりにＮａＣｌ（１％ｗ／ｗ）を使用したことを除いて同様に調製した。

電子システムのブロック図（図1gおよび補足図4）は、（1）イオン導入によって発汗を誘発し、（2）電気化学的方法によって汗を監視できるウェアラブル電子パッチとスマートウォッチの両方を表しています。発汗誘発および汗感知手順は、汎用非同期送受信機 (UART) 通信を介して Bluetooth モジュールからユーザーコマンドを受信すると、マイクロコントローラー (STM32L432KC、STMicroelectronics) によって開始および制御されます。

プログラム可能なイオン導入電流は、ユニティゲイン差動アンプ (AD8276、Analog Devices) とブーストトランジスタ (BC846、ON Semiconductor) で構成される電圧制御電流源によって生成されます。この回路は、3.7 V のバッテリ電圧を 36 V に昇圧するブーストコンバータ (LMR64010) の出力によって電力を供給されます。マイクロコントローラは、シリアルペリフェラルインターフェイスを介してデジタル - アナログコンバータ (DAC) (DAC8552、Texas Instruments) を制御し、電流源の制御電圧を設定します。電流源出力はコンパレータ (TS391、STMicroelectronics) によってチェックされ、出力障害時にマイクロコントローラは汎用入出力ピンを介して中断されます。保護回路は、電流リミッタ (MMBF5457、ON Semiconductor) とアナログスイッチ (MAX4715、Maxim Integrated、ADG5401、Analog Devices) で構成されています。マイクロコントローラーの汎用入出力は、イオン導入回路を有効または無効にするためにも使用されます。最適化された設計では、柔軟なマイクロ流体パッチを使用して、100 μA の電流 (約 2.6 μA mm-2) が身体イオントフォレーシスの発汗誘発に適用されました。

3.3 V で電力を供給すると、電子システムはアクティブな電気化学測定中に約 28 mA、イオントフォレーシス中に約 61 mA を消費します。マイクロコントローラーと Bluetooth モジュールはそれぞれ約 12 mA を消費します。センサーインターフェースは最大 4 mA を消費します。ブーストコンバーターとイオン導入モジュールは約 33 mA を消費します。また、ディスプレイモジュールは画面を更新するときにさらに約 8 mA を消費します。

汗感知回路は、2 チャンネルの同時 DPV、電位差測定および温度測定を実行できます。バイポテンシオスタット回路は、1 つのコントロールアンプ (AD8605) と 2 つのトランスインピーダンスアンプ (AD8606) で構成されます。直列電圧基準 (ISL60002、Renesas Electronics) および DAC (DAC8552、Texas Instruments) を使用して、基準電極と作用電極間に動的電位バイアスを生成します。計装アンプ (INA333、Texas Instruments) は電位差測定に使用され、分圧器は抵抗温度センサーに使用されます。すべてのアナログ電圧信号は、マイクロコントローラーの内蔵アナログ - デジタルコンバーター (ADC) チャネルによって取得され、処理されてから、Bluetooth 経由でユーザーデバイスに送信されます。

カスタムモバイルアプリケーションは、クロスプラットフォームの Flutter フレームワークを使用して開発されました。モバイルアプリケーションは、Bluetooth 経由でウェアラブルデバイスと無線通信して、コマンドを送信し、汗のバイオマーカーレベルを取得、処理、視覚化できます。アプリケーションはウェアラブルセンサーへの安全な Bluetooth 接続を確立します。ホームページには、ユーザーの過去のバイオマーカーレベルがプロットされ、最近測定された分析対象物濃度が強調表示されます。汗バイオマーカーの測定が求められると、ユーザーは汗センサーのボルタモグラムをリアルタイムでプロットする測定ページに切り替えることができます。ボルタンメトリー測定後、アプリはカスタムのベースライン補正アルゴリズムを使用してボルタンモグラムのピーク電流を抽出し、ピーク電流を対応するバイオマーカー濃度に変換します。これらの測定データは、ホームページ上の分析対象物レベルの履歴リストに追加されます。

リフレッシュ時間の解析は数値シミュレーション (COMSOL) を使用して実行されました。実際のデバイスと同じ寸法を持つ、さまざまなマイクロ流体設計の 3 次元モデルが Rhinoceros で作成され、COMSOL Multiphysics にインポートされました。物質輸送プロセスは、対流拡散方程式と結合した非圧縮性流れのストークス方程式を数値的に解くことによってシミュレートされました（補足注 3）。

汗センサーの検証と評価は、カリフォルニア工科大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコール (ID 19-0892 および 21-1079) に基づくすべての倫理規定に従ってヒト被験者を使用して実行されました。参加被験者（18歳以上）は、カリフォルニア工科大学のキャンパスおよび近隣地域から広告を通じて募集された。すべての被験者は研究参加前に書面によるインフォームドコンセントを得た。ウェアラブルセンサーの評価では、肥満指数（BMI）が 18.5 ～ 24.9 kg m-2、空腹時血清グルコースが 100 mg dl-1 未満の健康な被験者を採用しました。 BCAA 研究の対象基準は次のとおりです。グループ I、BMI が 18.5 ～ 24.9 kg m-2 で空腹時血清グルコースが 100 mg dl-1 未満（健康）、正常体重の個人。グループ II、BMI が 25 ～ 35 kg m-2、空腹時血清グルコースが 6 mg dl-1 未満の過体重/肥満の人 (過体重/肥満)。グループ III：BMI 25 ～ 35 kg m-2 および空腹時血清グルコース ≥126 mg dl-1 の肥満患者（肥満および T2DM）。 COVID-19 陽性および COVID-19 陰性の血清サンプルは RayBiotech から購入しました。

汗および血清サンプル中の AA の GC-MS 分析は、Phenomenex の EZ:Fast キットを使用して実行されました。これにより、サンプル前処理、誘導体化、および遊離 AA の GC-MS 分析が可能になります。 GC-MS の実行には Varian Saturn 2000 を使用しました。調製したサンプル溶液 1 マイクロリットルを、32 ℃で 110 °C から 320 °C にプログラムされたオーブンを使用して、ヘリウムキャリアガス中、1.0 ml min-1 の定流量、20 ポンド/平方インチのパルス圧で 0.2 分間 GC に注入しました。 ℃以上−1。質量クロマトグラフィーは、ソースを 240 °C、クワッドを 180 °C、補助を 310 °C、スキャン範囲 45 ～ 450 m/z、サンプリング速度 3.5 スキャン s-1 に設定しました。選択されたイオンモニタリングが使用され、予想される保持時間内の特定の AA の特徴である選択された質量でのイオン電流が記録されます 49。たとえば、EZ:Fast キットの誘導体化後、Trp は 130 に特徴的な質量を持ち、保持時間は約 5.1 分であり、生データスペクトルからイオン番号 130 と 5.1 分の Trp 測定のピーク高さが記録されます。。内部標準 (IS; ノルバリン) は、蒸発によりピーク検出が増加する可能性を考慮して、サンプルの誘導体化プロセス中に追加されました。 IS ノルバリンのピーク高さは、1.65 分のイオン番号 158 で記録されます (補足図 26)。生データスペクトルから記録された Trp ピーク高さは、同じ実行で IS に関して校正されました: 正規化された Trp ピーク高さ = Trp ピーク高さ/IS ピーク高さ。さまざまなレベルの Trp 標準の正規化されたピーク高さを使用して、キャリブレーションプロットを構築しました。他のサンプルについては、Trp の正規化されたピーク高さを使用して濃度を計算しました。

ウェアラブルセンサーシステムを検証するために、健常者を対象に定負荷サイクリング運動を実施しました。被験者は一晩絶食した後に研究室に報告し、標準化されたプロテインドリンク（フェアライフ、コアパワーエリート）を与えられました。センサーパッチを体に貼る前に、被験者の額と首をアルコール綿棒とガーゼで拭きました。サイクリングトライアルには、エアロバイク (Kettler Axos Cycle M-LA) が使用されました。被験者は 60 rpm で 60 分間、または疲労するまでサイクリングしました。身体装着試験中、センサーパッチからのデータは Bluetooth 経由でユーザーインターフェイスにワイヤレスで送信されました。被験者が自転車に乗り始めると、センサーシステムは継続的に温度とナトリウムのセンサーデータを取得して送信しました。毎分、電子システムは基準電極と作用電極の間に過渡電圧バイアスを開始しました。バイアスによって実験的に決定されたしきい値を超える電流がトリガーされると、システムは CV クリーニングサイクルを開始し、その後、ターゲットのインキュベーションを行わずに最初のバックグラウンドとして最初の DPV スキャンを開始します。 DPV スキャンを 7 分後にポストインキュベーション曲線として繰り返しました。 2 回のスキャンの間に、ナトリウムと温度センサーのデータが継続的に記録されました。インキュベーション後の DPV の直後に、IT クリーニング/再生ステップから別のサイクルが開始され、その後、最初のバックグラウンド DPV スキャンが続きました。収集された温度、ナトリウム、および DPV データは、Bluetooth を介してリアルタイムでユーザーデバイスに無線送信され、そこで分子データが抽出、校正され、濃度レベルに変換されました。研究中、遠心分離管を使用して被験者から汗のサンプルを定期的に収集しました。次に、バイオセンサーを使用した電気化学テストと GC-MS 分析によるさらなるテストと検証のために、汗サンプルを -20 °C で凍結しました。

被験者は一晩絶食した後、研究室に出勤した。被験者の腕は、センサーパッチを体に貼り付ける前にアルコール綿棒とガーゼで清められました。摂取研究のために被験者には Tyr および Trp サプリメント (各 1 g) が提供されました。対照的に、対照研究は、いかなる補助摂取も行わずに被験者に対して実施された。被験者には 5 分間のイオン導入が適用されました。センサーデータの記録プロセスは、運動ベースの人体実験と同じでした。

BCAA研究では、被験者に5 gのBCAA（2:1:1 Leu:Ile:Val）またはプロテインドリンク（フェアライフ、コアパワーエリート）とCLIFエネルギーバーを含む標準スナックを摂取してもらいました。発汗誘発のためにカルバコールゲルを使用したイオン導入セッションが実施されました。研究期間全体にわたって、被験者の汗が定期的に採取され、センサーパッチによって分析されました。血糖値は市販のCare Touch血糖計を用いて15分ごとに記録した。人間の研究では、指を刺すアプローチを使用して新鮮な毛細管血液サンプルが収集されました。指先をアルコールワイプで拭き、自然乾燥させた後、ケアタッチ穿刺装置で皮膚を穿刺した。血液の最初の一滴をガーゼで拭き取った後、サンプルを遠心分離管で採取した。 90 分間の標準化された凝固手順が終了した後、6,000 rpm で 15 分間遠心分離して血清を分離し、GC-MS、LEG-MIP センサー、カスタムインスリンアッセイによる分析のために即座に -20 °C で保存しました。

BCAA 食事チャレンジ研究では、カスタムのインスリンサンドイッチ免疫測定法を使用して、収集された血清サンプルを分析しました。 MB は以前の出版物に基づいて変更されました50。簡単に説明すると、3μl MBをMES緩衝液（25mM、pH5）中の50mg ml-1 EDC/スルホ-NHSで35分間活性化し、続いて捕捉抗体固定化（MES緩衝液中25μg ml-1）を15分間行った。リン酸緩衝液（0.1M、pH8）中の1Mエタノールアミンで非活性化した後、MBを、1％BSAで調製した25μlの標準溶液または1％BSAで5倍に希釈した血清サンプル中で15分間インキュベートした。ここから、各結合ステップの後にビーズを 1% BSA で 2 回リンスしました。次に、MB を 1% BSA 中のビオチン検出抗体 25 μl (1.0 μg ml-1) 中で 30 分間インキュベートし、続いて 1% BSA 中で調製したストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体 (2,500 ×) 中で 15 分間インキュベートしました。電流測定検出は、45μlの1mMヒドロキノンに再懸濁したMBに-0.2Vの定電位を印加することによって実行し、バックグラウンド電流が安定したときに、5μlの5mM H2O2をスクリーン印刷されたカーボン電極上にピペットで移した。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付ける主なデータは、論文とその補足情報で入手できます。図のソースデータ。図４および図５および補足図。図 36 および 39 ～ 41 は、このペーパーに付属しています。研究中に生成されたすべての生のデータセットと分析されたデータセットは、リクエストに応じて対応著者から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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このプロジェクトは、国立衛生研究所の助成金 R01HL155815、海軍研究局の助成金 N00014-21-1-2483 および N00014-21-1-2845、NASA NNX16AO69A を通じた宇宙保健トランスレーショナル研究所、NASA 協力協定 80NSSC20M0167 によって支援されました。ハイインパクトパイロット研究賞 T31IP1666 およびタバコ関連疾患研究プログラム、カリフォルニア工科大学希望都市生物医学イニシアチブパイロット助成金およびカリフォルニア工科大学ローゼンバーグイノベーションイニシアチブプログラムからの助成金 R01RG3746。 JT は、シンガポール科学技術研究庁 (A*STAR) の国立科学奨学金 (NSS) によって支援されました。私たちは、カリフォルニア工科大学カブリナノサイエンス研究所がこの研究に提供した重要なサポートとインフラストラクチャに感謝します。このプロジェクトは、カリフォルニア工科大学環境分析センターが提供する機器の利用から恩恵を受けており、N. Dalleska 氏の GC-MS に対するサポートに感謝します。また、モバイルアプリ開発への貢献については Z. Wang 氏、インスリンアッセイの最適化については RM Torrente-Rodríguez 氏、貴重なご意見については S. Bao 氏に感謝いたします。

Minqiang Wang、Yiran Yang、Jihong Min の著者も同様に貢献しました。

アンドリュー・チャーンとペギー・チャーンカリフォルニア工科大学工学応用科学部医療工学科、米国カリフォルニア州パサデナ

Minqiang Wang、Yiran Yang、Jihong Min、Yu Song、Jiaobing Tu、Cui Ye、Changhao Xu、Wei Gao

カリフォルニア工科大学、米国カリフォルニア州パサデナ、工学および応用科学部門、応用物理および材料科学部門

Daniel Mukasa

カリフォルニア工科大学工学応用科学部電気工学科、米国カリフォルニア州パサデナ

ニコール・ヘフリン

米国カリフォルニア州ドゥアルテ、シティ・オブ・ホープのベックマン研究所、血液悪性腫瘍トランスレーショナルサイエンス部門

ジャニーン・S・マッキューン

カリフォルニア大学ロサンゼルス校、デイビッド・ゲフィン医学部心臓病学部門、米国カリフォルニア州ロサンゼルス

ツン・K・シャイ

カリフォルニア大学ロサンゼルス校、デビッド・ゲフィン医学部、臨床栄養部門、米国カリフォルニア州ロサンゼルス

李昭平

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WG、MW、YY、JM がコンセプトを開始し、研究を設計しました。 WG が作業を監督しました。 MW、YY、JM が実験を主導し、全体的なデータを収集しました。 YS、JT、DM、CY、CX はセンサーの特性評価、検証、サンプル分析に貢献しました。 NH は信号処理とアプリ開発に貢献しました。 JSM、TKH、ZL は人体研究のデザインに貢献しました。 WG、MW、YY、JM がこの論文を共同執筆しました。著者全員がデータ分析に貢献し、原稿にフィードバックを提供しました。

魏高への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足説明、図、表、参考文献。

設計されたセンシングパッチとアプリを使用した身体上でのデモンストレーション。

マイクロ流体による汗リフレッシュのシミュレーションと検証。

安静時のイオン導入誘発マイクロ流体汗サンプリング。

図のソースデータ。図４、５および補足図。 36 と 39 ～ 41。

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転載と許可

Wang、M.、Yang、Y.、Min、J. 他。代謝産物と栄養素をモニタリングするためのウェアラブル電気化学バイオセンサー。ナット。バイオメッド。 Eng 6、1225–1235 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41551-022-00916-z

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受信日: 2021 年 6 月 7 日

受理日: 2022 年 6 月 19 日

公開日: 2022 年 8 月 15 日

発行日：2022年11月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00916-z

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